RNA提取
1.弃去培养液,用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS,用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。
6.往每个EP管中加入250ul,剧烈震荡30s, 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心,转速: 13500转1分钟,时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中,pcr检测,再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心,PCR实验室,转速: 13500转1分钟,时间: 10min.
11.弃去.上清液,加1m175%乙醇,轻摇7]。
12. 4C离心,10600转/分钟,时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解,-80C保存。进行逆转录前测浓度。
组织RNA提取
1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨,以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
RNA提取预备工作
RNA酶(Rnase)是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定,pcr实验室,在一些的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴手套
2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(1)塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,pcr,通常不必再处理。
蛋白质质谱鉴定服务
蛋白质(protein)是有机大分子,是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、新陈代谢、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。蛋白质的一级结构是氨基酸序列,通过鉴定氨基酸序列来匹配它的蛋白质,这是定性研究,是蛋白质组学的基础,也是蛋白质组学的重要技术之一。
质谱一般由离子源、质量分析器(Mass analyzer)和离子检测器(Detector)三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析,但随着新的离子化技术的出现,如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)等,质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。现在蛋白质组学基本研究手段是:以生物质谱技术为,对蛋白质进行大规模、高通量分离、鉴定和分析。
蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质消化成肽段混合物,经MAILDI或ESI等软电离手段将其离子化,然后通过质量分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对,进行蛋白鉴定。
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