STR检测
短串联重复(Short tandem repeats, STR),又称微wei星DNA(Microsatellite DNA)或简单重复序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR),是广泛存在于原核生物和真核生物基因组中的核苷酸重复序列。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因,并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间,fu制滑动发生的概率也不相同。
STR是以序列 (core repeat units) 首尾相连多次重复形成。每个STR的序列结构相同,pcr引物设计,长度为2-6bp,但其重复单位数目和重复区域的长度不同,因此STR在不同种族、不同人群之间的分布具有差异性,构成了STR遗传多态性。不同个体之间在一个同源STR位点的重复次数也不同,因而同指纹识别一样,STR位点分析也可对个体进行身份识别。通过识别个体基因组在特定位点的特定序列重复,即可创建其基因档案。基于此,STR分析法已经成为一种重要的鉴定分析方法,应用于法医学、qin子鉴定及细胞鉴定等领域。
DNA测序检测
1. PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDye Mix
1μl
1μl
待测的质粒DNA
1μ 1
pGEM-3Zf ( )双链DNA
-1μ1
待测DNA的正向引物
1μ 1
M13(-21)引物- 1μ 1
灭菌去离子水
2μ 1
2μ 1
总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环,
PCR循环参数为96C 10s, 50C 5s, 60°C4min,pcr, 25 个循环,PCR,扩增结束后设置4C保温。
2.乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2)加入25μ 1/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于
4C离心30 min,小心弃上清。
(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和
管壁的液珠,荧光定量pcr,真空干燥沉淀10~ 15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理。
(1)加入12μ 1的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心。
(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷,待_上机。
4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立
运行的测序顺序文件。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过
序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
EMSA实验
EMSA:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和DNA序列相结合的技术,初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用,可用于定性和定量分析。分为2种类型:同位素标记探针,非同位素标记探针。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚bing烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
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