RIP
技术概述
RIP是研究体内蛋白与RNA互作的重要技术。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-RNA”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-RNA”互作复合物，去交联分离其中的RNA;针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物，
做qPCR实验，验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的RNA做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。
技术流程
细胞交联-→细胞裂解-→免l疫共沉淀→去交联→RNA分离→建库→高通量测序(或qPCR)。
动物组织细胞基因组DNA提取
操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K
（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另
一离心管中。
2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，实时荧光定量pcr，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚??振荡混匀，广西pcr，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。
6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，荧光定量pcr，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
蛋白质双向电泳实验流程
1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL，否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。
(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min，15W/胶 5-8hr，20℃。
3.银染法对凝胶进行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗
3.凝胶扫描及图像分析
(1)图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。
(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，基因检测怎么做，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
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