自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器,终将吞食物在溶酶体内降解的过程,自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构,内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物,损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、
病毒和细菌等。单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一种荧光色素,是嗜酸性染色剂,通常被于检测自噬体形成的特异性标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm ,阻断滤光片波长512nm。Leagene MDC染色液适用于培养细胞的自噬染色,可与EB合用双染。
细胞转染实验
目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法,观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白),为染色准备实验材料。
实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图,它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法:法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒细胞的方法使得其进入细胞。但是由于法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
4. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样;上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些,细胞实验外包,-2~-3℃/ 分钟合适;胚胎细胞耐受性较小,不宜太快。总之在一开始时,下降速度不能超过-10℃/ 分钟。
5. 用什么防护剂合适和用量多大,要依细胞而定,攀枝花细胞实验,初代培养细胞用 DMSO 较好,细胞实验外包费用,一般细胞可用甘油;用量以较小为好。有人认为肤上皮细胞贮存在 20%-30% 甘油中很好。
6. 原则上细胞在液氮中可贮存多年,但为妥善起见,冻存一年后,应再复苏培养一次,然后再继续冻存。
7. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免
8. 注意自身的安全,对于来自人源性或病毒的细胞株应特别小心。操作过程中,细胞实验外包哪家好,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂例如 DMSO,并避免尖锐物品伤人等。
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